Ваш браузер устарел. Рекомендуем обновить его до последней версии.

Lactobacillus reuteri DSM 17 938 при детских коликах: рандомизированное, двойное слепое, плацебо контролируемое исследование.

Francesco Savino, Lisa Cordisco, Valentina Tarasco, Elisabetta Palumeri, Roberto Calabrese, Roberto Oggero, Stefan Roos и Diego Matteuzzi Pediatrics опубликовано в интернете 16 августа 2010 г.
DOI: 10.1542/peds.2010-0433.

Онлайн версия данной статьи вместе с обновленной информацией и услугами представлена в интернете по адресу: http://www.pediatrics.org

PEDIATRICS является официальным журналом Американской академии педиатров (American Academy of Pediatrics). Издается один раз в месяц с 1948 года. Американская академия педиатров владеет, публикует и является владельцем товарного знака PEDIATRICS: American Academy of Pediatrics, 141 Northwest Point Boulevard, Elk Grove Village, Illinois, 60007. Авторское право ©
2010 принадлежит Американской академии педиатров (American Academy of Pediatrics). Все права защищены. ISSN для печати: 0031-4005. ISSN для публикации в интернете: 1098-4275.

ИЗВЕСТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ ПО ДАННОЙ ТЕМЕ. В данной статье описано клиническое исследование детских колик, она является ожидаемым продолжением статьи, опубликованной в журнале Pediatrics в 2007 г. Ранее проведенное исследование вызвало интерес у врачей, но оно не являлось двойным слепым, плацебо контролируемым исследованием.

НОВАЯ ИНФОРМАЦИЯ, ПОЛУЧЕННАЯ ИЗ ДАННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ. Представленные данные получены из проспективного, рандомизированного, двойного слепого, плацебо контролируемого исследования с участием детей с коликами, находящимися на грудном вскармливании. Была продемонстрирована польза добавления L reuteri DSM 17 938. Микробиологический анализ стула детей выявил изменение кишечной микробиоты.

РЕЗЮМЕ.

ЦЕЛЬ. Оценка эффективности Lactobacillus reuteri при детских коликах и оценка ее взаимосвязи с микробиотой кишечника.

ДИЗАЙН ИССЛЕДОВАНИЯ. Пятьдесят детей, получающих только грудное молоко и страдающих коликами, диагностированными в соответствии с критериями Wessel, были случайным образом распределены на ежедневное получение L reuteri DSM 17 938 (108 колониеобразующих единиц) или плацебо в течение 21 дня. Родители ежедневно заполняли опросники для регистрации времени плача и возникновения побочных эффектов. Были отобраны образцы стула для микробиологического анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ. 46 детей (группа L reuteri: 25; группа плацебо: 21) закончили участие в исследовании. Время ежедневного плача в минутах/днях (медианное) составило 370 (120) по сравнению с 300 (150) (P = 0,127) в день 0 и 35,0 (85) по сравнению с 90,0 (148) (P = 0,022) в день 21, в группе L reuteri и группе плацебо, соответственно. Значительно большее количество детей отреагировали на добавки (50% уменьшение времени плача по сравнению с исходным уровнем) в группе L reuteri по сравнению с группой плацебо в день 7 (20 по сравнению с 8; P = 0,006), 14 (24 по сравнению с 13; P = 0,007) и 21 (24 по сравнению с 15; P = 0,036). Во время исследования наблюдалось значительное увеличение фекального уровня молочнокислых бактерий (P = 0,002) и уменьшение фекального уровня Escherichia coli и аммиака только в группе L reuteri (P = 0,001). Различия в наборе веса, частоте стула и частоте запоров или срыгивания между группами отсутствовали. Нежелательные явления, связанные с пробиотиками, не наблюдались.

ВЫВОД. L. reuteri DSM 17 938, применяемые в дозе 108 колониеобразующих единиц в сутки у детей, находящихся на грудном вскармливании, облегчали симптомы детских колик, хорошо переносились и были безопасными. Изменения кишечной микробиоты, вызванные пробиотиком, можно считать наблюдаемым клиническим улучшением.

АВТОРЫ. Francesco Savino, доктор медицины, доктор философии, (a) Lisa Cordisco, доктор философии, (b) Valentina Tarasco, доктор медицины, (a) Elisabetta Palumeri, доктор медицины, (a) Roberto Calabrese, бакалавр наук, (a) Roberto Oggero, доктор медицины, (a) Stefan Roos, доктор философииc и Diego Matteuzzi, доктор философии (b).

(a) Отделение педиатрии, детская больница Regina Margherita Children Hospital,
университет Турина, Турин, Италия;

(b) Фармацевтическое отделение, университет Болоньи, Болонья, Италия;
(c) Отделение микробиологии, шведский университет сельскохозяйственных наук, Упсала,
Швеция.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА

Lactobacillus reuteri, детские колики, колики у новорожденных, FISH, кишечная микрофлора, Escherichia coli.

СОКРАЩЕНИЯ
FISH — флюоресцентная гибридизация in situ.
IQR — межквартильный размах.

Данное исследование зарегистрировано на веб-сайте www.clinicaltrials.gov (идентификационный номер 00893711).
Д-р Savino разрабатывал протокол в качестве главного исследователя, он создал отчет о результатах исследования; д-р Cordisco выполняла микробиологический анализ, в частности анализ бактериальных групп методом FISH и анализ на выявление фекального аммиака; д-р Tarasco участвовала в разработке протокола и написании отчета о результатах исследования, она была ответственна за скрининг, набор и оценку результатов пациентов; д-р Palumeri участвовала в разработке протокола и написании отчета о результатах исследования; г-н Calabrese выполнил заключительный анализ данных; д-р Oggero внес вклад в написание отчета о результатах исследования; д-р Roos выполнял микробиологический анализ, в частности анализ фекальных L reuteri DSM 17 938 и д-р Dr Matteuzzi был главным ответственным лицом за проведение микробиологического анализа и внес вклад в написание отчета о результатах исследования.

www.pediatrics.org/cgi/doi/10.1542/peds.2010-0433
doi:10.1542/peds.2010-0433
Принято для публикации: 27 мая 2010 г.
Почтовый адрес: Francesco Savino, MD, PhD, Department of Pediatrics, Regina Margherita
Children Hospital, Piazza Polonia, 94 10126 Turin, Italy.
Адрес электронной почты: francesco.savino@unito.it
PEDIATRICS (номера ISSN: для печати 0031-4005; для публикации в интернете 1098-
4275).

Авторское право © 2010 принадлежит Американской академии педиатров (American Academy of Pediatrics).

РАСКРЫТИЕ ФИНАНСОВОЙ ИНФОРМАЦИИ. 

Авторы указали, что у них отсутствует финансовая взаимосвязь в отношении данной статьи. 

Детские колики, определяемые как пароксизмальный, избыточный и безутешный плач без идентифицируемой причины у здоровых новорожденных детей, широко распространен в первые три месяца жизни. (1,2) Классическое определение детских колик основано на правиле трех составляющих: беспокойный плач, который продолжается в течение ≥ 3 часов в день, в течение ≥ 3 дней в неделю и в течение не менее 3 недель. (3) Коликами страдают 3% - 28% детей, вызывая значительный стресс и волнение у родителей. (4) Патогенез данного состояния еще не выяснен, хотя данные указывают на многочисленные независимые причины.2 Недавно было сделано предположение, что нарушенная кишечная микрофлора поражает двигательную функцию кишечника и выработку газов, что ведет к появлению колик. (5) У детей с коликами было выявлено повышенное содержание водорода, вырабатываемого анаэробными грамотрицательными бактериями, и низкий уровень и особые формы колонизации кишечных молочнокислых бактерий. (6,7) Недавно было обнаружено, что колиформные бактерии, в частности Escherichia coli, преобладают в стуле детей с коликами, указывая, что для плачущих детей типичны колиформная ферментация толстой кишки, последующая избыточная выработка воздуха в кишечнике и боль. (8) Rhoads и соавторы (9) продемонстрировали, что у данных пациентов отмечается повышенный уровень фекального кальпротектина и высокий уровень Klebsiella, указывая на важную роль микробиоты. Ранее в проспективном, рандомизированном исследовании добавление пробиотика Lactobacillus reuteri ATCC 55 730 облегчило колики у детей на грудном вскармливании по сравнению с лечением симетиконом уже на первой неделе. (10) Недавно было выяснено, что этот штамм обладает специфическими, необычными свойствами потенциально переносимой резистентности к тетрациклину и линкомицину, что привело к разработке нового дочернего штамма, L reuteri DSM 17 938, полученного из L reuteri ATCC 55 730 путем естественного удаления этой нежелательной резистентности, расположенной в плазмидах. Дочерний штамм сохранил пробиотические свойства, а также безопасность и переносимость у взрослых.11 Цель настоящего, рандомизированного, двойного слепого, плацебо контролируемого исследования заключалась в подтверждении этих клинических данных и выявлении связи с изменениями в микробиологических профилях стула.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Пациенты

Данное рандомизированное, контролируемое, двойное слепое исследование проводилось с участием 50 детей, находящихся на грудном вскармливании (29 мальчиков). Участие в исследование предлагалось пациентам педиатров и амбулаторным пациентам в отделении педиатрии, университета Турина (детская больница Regina Margherita Children Hospital) с марта 2008 г. по август 2009 г. Всем детям был поставлен диагноз детские колики в соответствии с модифицированными критериями Wessel: беспокойный плач, который продолжался в течение ≥ 3 часов в день, в течение ≥ 3 дней в неделю перед зачислением в исследование. Все дети были рождены в надлежащий срок (вес при рождении: 2500–4000 г), в момент начала участия в исследовании возраст детей составлял 2-16 недель. В исследовании участвовали только дети, находящиеся исключительно на грудном вскармливании, для исключения вариабельности кишечной микрофлоры, к которой может привести искусственное вскармливание. При зачислении в исследовании матерям рекомендовалось избегать употребления коровьего молока, соответствие этому правилу оценивалось во время визита последующего наблюдения. Критерии исключения включали клинические признаки хронического заболевания или нарушения функции желудочно-кишечного тракта, прием пробиотиков и/или антибиотиков в течение недели, предшествующей началу участия в исследование и употребление детских смесей. Поскольку гастроэзофагеальный рефлюкс являлся критерием исключения, дети, закончившие участие в исследовании не применяли блокаторов кислотообразования. Исследование было одобрено местным комитетом по вопросам этики (Comitato Interaziendale AA.SS.OO. O.I.R.M./S. Anna-Ordine Mauriziano di Torino) до его начала, родители предоставили письменное информированное согласие перед включением детей в исследование.

Цели и результаты исследования

Основным показателем считалось уменьшение среднего времени плача до < 3 часов в сутки (показатель, предложенный Wessel) к 21дню. Дополнительный показатель определялся, как количество детей, отреагировавших на лечение в каждой группе на 7, 14 и 21день. Дети, отреагировавшие на лечение (определение предоставлено в протоколе), - это пациенты, у которых наблюдалось уменьшение среднего ежедневного времени плача на 50% по сравнению с исходным уровнем. Кроме этого, проводился анализ кишечной микрофлоры детей для определения действия пробиотика на определенную кишечную микрофлору (E coli, Clostridium butyricum, Lactobacillus и Bifidobacterium), использовался метод флюоресцентной гибридизации in situ (FISH).

Дизайн и выборка исследования

Сбор данных

Дети, страдающие коликами, случайным образом распределялись на получение L reuteri DSM 17 938 или плацебо, используя список рандомизации, созданный на компьютере независимым статистиком отдела (г-н Calabrese). Рандомизация проводилась методом случайных цифр, основанном на цифрах, выбранных компьютером. Мы использовали схему рандомизации на два типа лечения со случайным блоком переменного объема (Stata 9 [Stata Corp, College Station, Техас] процедура Ralloc). Педиатры назначали следующий доступный препарат при вступлении в исследование, каждый пациент получал исследуемый препарат непосредственно в отделении. Активный исследуемый препарат состоял из суспензии лиофилизированной L reuteri DSM 17 938 в комбинации с подсолнечным маслом и триглицеридом средней цепи и поставлялся в 5 мл бутылочке из темного стекла, закрытой крышкой с дозатором. Плацебо выглядело аналогичным образом и имело аналогичный вкус, но не содержало живых бактерий. Доза обоих составов составляла 5 капель один раз в сутки за 30 минут перед утренним кормлением в течение 21 дня. Во время исследования родители должны были хранить препарат в холодильнике. Статистик исследования присваивал бутылочке код – ни участники исследования, ни врачи не знали, содержит ли бутылочка исследуемый препарат или плацебо. Код раскрывался исследователям после окончания набора в исследование, сбора данных и всех лабораторных и статистических анализов.
Во время зачисления (день 0) родителей расспрашивали о гестационном возрасте, родах, весе при рождении, наличии желудочно-кишечных заболеваний и времени плача.
Проводился медицинский осмотр, параметры роста фиксировались на исходном уровне и в день 21. Родителей просили заполнять структурированный дневник каждый день во время участия в исследовании для регистрации времени плача (в минутах), характеристик и частоты стула и наблюдаемых побочных эффектах (запор, рвота и кожные реакции). Для определения переносимости проводилась оценка параметров роста (набор веса в сутки), характеристик стула (частота и консистенция), симптомов непереносимости (запор, срыгивание или рвота) и частоты возникновения нежелательных явлений во время периода лечения. Нежелательные явления (заболевания, признаки или симптомы, возникшие или ухудшившиеся во время исследования) оценивались с помощью оценок родителей в ежедневных записях. Для оценки различий параметров роста между группами в различные временные точки (день 0-21) использовалась линейная модель повторных измерений. Визиты последующего наблюдения проводились одним и тем же педиатром в день 7 и 21. Исследователь брал образцы стула (10-15 г) у каждого пациента для проведения микробиологического анализа, непосредственно с памперса или из анального отверстия в день зачисления и в день 21. Образцы (маскированные) хранились при температуре -20°C до проведения анализа.

Анализ бактериальной группы методом FISH

Кишечные бактериальные группы классифицировались с применением специальных коммерческих комплектов FISH (Microscreen B.V.; Microbial Diagnostics, Groningen, Голландия) на группу Lactobacillus (Lactobacillus 10-ME-H006), род Bifidobacterium (Bifidobacterium 10-MEH001), группу E coli (Escherichia 1 coli 10-ME-H004) и C butyricum (C butyricum 10-ME-H009). Предметные стекла классифицировались в трех экземплярах с использованием эпифлуоресцентного микроскопа Nikon Eclipse E-600, оборудованного ртутной дуговой лампой (HBO, 100 Ватт [Nikon, Токио, Япония]) и фильтром для флуоресцеинизотиоцианата Nikon BA 520. В зависимости от количества флюоресцирующих клеток оценивались 30-100 полей зрения микроскопа, которые округлялись для каждого предметного стекла.

Анализ L reuteri DSM 17 938 в стуле

Образцы стула размораживались при комнатной температуре. 0,3-0,5 г суспендировались в растворе пептонной воды (10% масса/объем). Затем данную суспензию разводили в соотношении 1:10 в пептонной воде и высевали на агар Рогоза (Oxoid, Кембридж, Великобритания]) с добавлением 2 мкг/мл ампицилина (Sigma-Aldrich, Стокгольм, Швеция]) для селективного выращивания штаммов L reuteri с резистентностью к ампицилину. Чашки инкубировались при температуре 37°C в течение 48 часов анаэробно (AnaeroGen, Кембридж, Великобритания]). Колонии (5 на чашку) анализировались с проведением анализов полимеразной цепной реакции, специфической для определенных штаммов, описанных Egervärn и соавторами,12. Однако в нашем случае использовался комплект для ПЦР DreamTaq Green PCR Master Mix Kit (Fermentas, Burlington, Онтарио, Канада).

Анализ аммиака в стуле

Аммиак в стуле определялся колориметрически в соответствии с описанием Searcy и соавторов 13, путем проведения ферментного колориметрического анализа (мочевина/АМК — цвет [BioSystems S.A., Барселона, Испания]).(14)

Статистический анализ

Размер выборки рассчитывался таким образом, чтобы получить клинически значимое различие в уменьшении среднего времени плача в сутки, которое составило бы 50 минут между группами. В каждую группу было необходимо включить по 20 пациентов, причем α = 0,05, β = 0,20, а рассчитанное стандартное отклонение в группах составляло 55 минут. В каждую группу было зачислено 25 пациентов с учетом 20% показателя выбывания. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение или медианного значения и межквартильного размаха (IQR) для непрерывных переменных при необходимости и в виде числа и процента для категориальных переменных. Различия между группами оценивались с применением критерия Стьюдента для независимых выборок или критерия Манна-Уитни при необходимости, взаимосвязь между категориальными переменными оценивались с применением точного критерия Фишера.
При необходимости для оценки различий между парными выборками для непрерывных переменных использовался критерий Уилкоксона и критерий Фридмана. Различия в уровне бактерий в день 21 и день 0 были проанализированы с применением критерия Манна-Уитни. Данные пациентов, ответивших на лечение, были проанализированы с учетом всех рандомизированных пациентов, причем пациенты, вышедшие из исследования, считались ответившими на лечение, поскольку они все были из группы плацебо. Все зафиксированные значения P были двусторонними, различия считались значимыми, если P < 0,05. Анализ данных проводился с применением SPSS 16 (SPSS Inc, Чикаго, Иллинойс), а расчет размера выборки был выполнен с применением NCSSPASS 2000 (Number Cruncher Statistical Systems, Kaysville, Юта).

Рис. 1. Зачисление пациентов и ход исследования

Значительные различия между группами в отношении типа родов, пола, возраста при включении в исследование, семейной истории желудочно-кишечных заболеваний или атопических заболеваний или параметров отсутствовали (таблица 1).

Таблица 1. Характеристики участников на исходном уровне                                                                                                                                                                                                                                                             

Переменная

Плацебо (n = 25)

L reuteri (n = 25)

Р

Тип родов (кесарево сечение), n ( %)

6 (25)

13 (52)

0,079a

Мальчики, n ( %)

14 (56)

15 (60)

0,999a

Возраст при включении в исследование, медианный (IQR), дней

28,5 (21)

32,5 (21)

0,382b

Семейная история желудочно-кишечных заболеваний (да), n ( %)

8 (32)

6 (24)

,754a

Семейная история атопических заболеваний (да), n ( %)

9 (36)

12 (48)

0,567a

Вес при включении в исследование ± SD, г

4378,5 ± 795,0

4418,4 ± 723,6

0,854c

Рост при включении в исследование,

средний ± SD, см

54,4 ± 2,4

54,4 ± 2,6

0,999c

Объем головы при включении в

исследование, средний ± SD, см

37,3 ± 1,5

36,9 ± 1,4

0,286c

Частота стула при включении в

исследование, медианная   (IQR)

4,8 (2,4)

3,5 (3,1)

0,146b

(a) точный критерий Фишера.
(b) критерий Манна-Уитни.
(c) критерий Стьюдента.

При зачислении разница в медианном времени плача (минут в сутки) между группами отсутствовала: 370 (IQR: 120) по сравнению с 300 (IQR: 150) в группе L reuteri и группе плацебо, соответственно (P = 0,127). У детей с коликами, получающих пробиотик, отмечалось значительное уменьшение времени плача в конце исследования (день 21) по сравнению с группой плацебо: 35 (IQR: 85) по сравнению с 90,0 (IQR: 148) минут в сутки, соответственно (P = 0,022) (таблица 2). При зачислении все дети плакали в течение более 180 минут в сутки в обеих группах в соответствии с критериями включения. Ко дню 21 количество пациентов, которые плакали более 180 минут, значительно уменьшилось в группе L reuteri по сравнению с группой плацебо (4 по сравнению с 12, соответственно; P
= 0,009).

Таблица 2. Время плача в группе L reuteri и в группе плацебо

День исследования

L reuteri (n = 25), медианное

(IQR), минут в сутки

Плацебо (n = 21), медианное

(IQR), минут в сутки

Р (а)

0

370 (120)

300 (150)

0,127

7

95 (85)

185 (149)

0,082

14

60 (70)

150 (145)

0,099

21

35 (85)

90 (148)

0,022

Длительность плача оценивалась с помощью ежедневной оценки родителей в структурированных дневниках. (a) критерий Манна-Уитни.

В группе пробиотика отмечалось значительно большее количество пациентов, отреагировавших на лечение, чем в группе плацебо в день 7 (20 по сравнению с 8; P = 0,006), день 14 (24 по сравнению с 13; P = 0,007) и в день 21 (24 по сравнению с 15; P = 0,036) (рис. 2). Анализ рандомизированных пациентов продемонстрировал, что в группе L reuteri количество пациентов, отреагировавших на лечение, всегда было значительно большим, чем в группе плацебо (день 7: 21 по сравнению с 11; P = 0,007; день 14: 24 по сравнению с 16; P = 0,011; день 21: 24 по сравнению с 18; P = 0,049).

Пациенты, отреагировавшие на лечение:

 

Рис. 2
Эффективность (количество пациентов, отреагировавших на лечение) L reuteri по сравнению с плацебо во время исследования. Дети были классифицированы как отреагировавшие на лечение, если у них отмечалось уменьшение среднего времени плача (в минутах) на 50% по сравнению с оценкой исходного уровня. Столбцы демонстрируют процент пациентов, отреагировавших на лечение в каждой группе в день 7, 14 и 21 приприеме добавки. Статистический анализ был выполнен с применением критерия Манна-Уитни. a день 7, P = 0,006; b день 14, P = 0,007; и c день 21, P = 0,036.

Микробиологический анализ культур стула
Микробиологические группы культур стула
Количество Lactobacillusbifidobacteria и Clostridium butyricum в стуле было одинаковым в обеих группах, но уровень E coli был выше в группе L reuteri в начале исследования (таблица 3). В ходе исследования в группе пробиотика отмечалось более значительное уменьшение количества E coli, чем в группе плацебо (-6,55 х 107 [IQR: 4,87 х 108] по сравнению с 4,30 х 105 [IQR: 4,35 х 107], соответственно; P = 0,001). Количество молочнокислых бактерий значительно увеличилось в группе L reuteri по сравнению с группой плацебо (4,07 х 105 [IQR: 4,98 х 106] по сравнению с 0 х 100 [IQR: 3,27 х 104]; P = 0,002). Различий в количестве Bifidobacteria (P = 0,907) или C butyricum (P = 0,458) не наблюдалось (таблица 3 и 4).

Таблица 3. Виды бактерий на грамм стула и уровень аммиака в начале и в конце исследования

 

День 0

День 21

Плацебо

L reuteri

Плацебо

L reuteri

Медианно

е (IQR)

P

Медианно

е (IQR)

P

Медианно

е (IQR)

P

Медианно

е (IQR)

P

Бактерия / переменная, вид на г

E coli

2,49 х 106

(4,53 х 107)

0,006

1,54 х 108

(6,61 х 106)

0,006

2,85 х 107

(1,78 х 108)

0,181

2,70 х 107

(4,19 х 108)

0,181

C butyricum

1,84 х 106

(6,79 х 107)

0,562

4,26 х 106

(2,62 х 107)

0,562

2,70 х 105

(7,79 х 106)

0,377

1,96 х 106

(4,83 х 107)

0,377

Lactobacillus

8,20 х 103

(2,10 х 105)

0,988

8,40 х 103

(3,00 х 105)

0,988

9,99 х 102

(7,00 х 105)

0,015

4,15 х 105

(7,21 х 106)

0,015

Bifidobacteria

2,28 х 109

(6,20 х 109)

0,638

2,26 х 109

(4,60 х 109)

0,638

2,85 х 109

(9,80 х 109)

0,717

3,19 х 109

(4,70 х 109)

0,717

Аммиак, мг/л

1,44 (3,15)

0,064

2,59 (2,56)

0,064

1,65 (3,12)

0,665

1,05 (1,74)

0,665

Род и вид фекальных бактерий анализировался методом FISH. Количество образцов стула для каждого
анализа – 2. Значение P рассчитывалось с применением критерия Манна-Уитни.

Таблица 4. Виды бактерий на грамм стула и колебания уровня аммиака в день 21-0 в группах исследования

 

Разница между днем 21 и днем 0, медианная (IQR)

P

 

Плацебо

L reuteri

 

Бактерия / переменная, вид на г

E coli

4,30 х 105 (4,35 х 107)

-6,55 х 107 (4,87 х 108)

0,001

C butyricum

-1,00 х 100 (5,91 х 106)

0,00 х 100 (1,52 х 107)

0,458

Lactobacillus

0,00 х 100 (3,27 х 104)

4,07 х 105 (4,98 х 106)

0,002

Bifidobacteria

0,00 х 100 (3,09 х 109)

2,19 х 108 (2,52 х 109)

0,907

Аммиак, мг/л

0,33 (0,81)

-1,10 (1,60)

<0,001

Количество образцов стула для каждого анализа – 2. Значение P рассчитывалось с применением критерия
Манна-Уитни.

Анализ L reuteri DSM 17 938 в стуле
Образцы стула были проанализированы у 26 из 50 детей (по 13 из каждой группы, при наличии образцов). У двенадцати из 13 детей, принимающих пробиотик, были выявлены L reuteri DSM 17 938 в стуле в день 21 (рис. 3), у детей, получающих плацебо, L reuteri DSM 17 938 выявлены не были. Среднее количество L reuteri DSM 17 938 у этих детей составило 2,8 х 104 колониеобразующих единиц на грамм стула.

 

Рис. 3 Колонии L reuteri DSM 17 938, выявленные в стуле детей из группы, получающей L reuteri DSM 17 938. Показаны колонии L reuteri DSM 17 938, выявленные в стуле ребенка из группы L reuteri в день 21. Колонии были выращены на агаре Рогоза с добавлением 2 мкг/мл ампицилина для селективного выращивания штаммов L reuteri с резистентностью к ампицилину. Было подтверждено, что колонии являются L reuteri DSM 17 938 проведения анализа полимеразной цепной реакции, специфической для определенных штаммов.

Уровень аммиака в стуле
Уровень аммиака в стуле (мг/L reuteri) в день 0 составил 1,44 (IQR: 3,15) и 2,59 (IQR: 2,56) в группе плацебо и группе L reuteri, соответственно (P = 0,064). В группе пробиотика в ходе исследования отмечалось значительное уменьшение уровня аммиака в стуле по сравнению с группой плацебо (таблицы 3 и 4).

Безопасность и переносимость
Отмечался значительный рост в обеих группах, на что указывают показатели веса, роста и объема головы (P < 0,001) (таблица 5), однако были зафиксированы небольшие различия между группами. Средний набор веса был равным в обеих группах (медианное количество грамм в сутки составило 34,3 (IQR: 16,1) в группе L reuteri и 29,9 (IQR: 19,4) в группе плацебо; P = 0,140). В обеих группах наблюдалась одинаковая работа желудочно-кишечного тракта (таблица 6). Нежелательные явления, наблюдаемые в ходе исследования, включали ринит (группа L reuteri, n = 1), экзему (группа плацебо, n = 1), высокую температуру (группа плацебо, n = 1), оталгию (группа плацебо, n = 1) и гастроэзофагеальный рефлюкс (группа плацебо, n = 1). Все явления не были связаны с приемом исследуемого препарата.

Таблица 5. Параметры роста в группах исследования

Переменная

При включении,

среднее ± SD

Через 1 неделю,

среднее ± SD

Через 3 недели,

среднее ± SD

Плацебо

L reuteri

Плацебо

L reuteri

Плацебо

L reuteri

Вес

4379 ± 795

4418 ± 724

4619 ± 844

4678 ± 727

5079 ± 864

5177 ± 648

Рост

54,4 ± 2,4

54,4 ± 2,6

Нет

данных

Нет

данных

55,3 ± 2,5

55,2 ± 2,6

Объем

головы

37,3 ± 1,5

36,9 ± 1,4

Нет

данных

Нет

данных

38,1 ± 1,5

37,7 ± 1,3

Значительные различия между группами отсутствовали.

Таблица 6. Параметры желудочно-кишечной функции у пациентов исследования

Переменная

Плацебо (= 25)

L reuteri (= 25)

P

Частота стула при включении в

исследование, медианная (IQR), d

4.8 (2.4)

3.5 (3.1)

0.146a

Частота стула через 1 неделю,

медианная (IQR), d

4,0 (1,4)

4,0 (2,6)

Не

значительное

Частота стула через 3 недели,

медианная (IQR), d

3,0 (1,9)

3,5 (2,1)

0,906a

Запор у детей, (%)

11 (46)

8 (31)

0,383b

Срыгивание у детей, (%)

2 (8)

4 (15)

0,669b

a - критерий Манна-Уитни.
b - точный критерий Фишера.

ОБСУЖДЕНИЕ

Увеличение данных, полученных из контролируемых должным образом клинических исследований об эффективности определённых пробиотических штаммов лактобактерий, приводит к широкому использованию пробиотиков в клинической практике. Недавно было продемонстрировано, что кишечная микрофлора и экзогенные пробиотики оказывают значительное воздействие на кишечную функцию путем иммунофизиологической регуляции в барьере слизистой оболочки кишечника, что открывает новые перспективы в питании. (15) Что касается детей, цель добавления пробиотика заключается в обеспечении безопасного и достаточного микробного стимула для незрелой иммунной системы, воздействующего на противовоспалительные свойства кишечной среды. (16) В данном исследовании дети, получающие L reuteri DSM 17 938, продемонстрировали значительное уменьшение суточного времени плача, подтверждая воздействие пробиотика на симптомы колик у детей, находящихся на грудном вскармливании, в ходе проведения двойного слепого, рандомизированного, плацебо контролируемого исследования. Основной показатель продемонстрировал значительное воздействие добавок L reuteri DSM 17 938 в день 21, но анализ пациентов, отреагировавших на лечение, выявил, что положительное действие отмечалось уже в день 7, и лучшие результаты были на 21 день, что также подтверждает более ранние наблюдения.(10) Возможный механизм действия L reuteri включает улучшение моторики и функции кишечника17 и непосредственное воздействие на висцеральную боль, (18,19) оба этих воздействия могут облегчить состояние и уменьшить длительность плача у детей. IKunze и соавторы18 предположили, что эффект пробиотика обусловлен опосредованным воздействием на внутренние сенсорные нейроны толстой кишки. В модели на животных они продемонстрировали, что прием L reuteri повышал возбудимость миэнтерического AH нейрона, уменьшая при этом размер медленной следовой гиперполяризации, опосредованной открытием кальций-зависимого канала К+ с промежуточной проводимостью. Кроме этого, Wang и соавторы (19) продемонстрировали, что прием reuteri может стимулировать тоническое ингибирование сократительной активности толстой кишки крыс, действуя через ток кальций-зависимого канала К+ с промежуточной проводимостью в миэнтерических клетках AH. Они предположили, что модуляция моторики через возбудимость клеток AH может быть путем, посредством которого пробиотики влияют на внешние сенсорные нейроны и тем самым на активность центральной нервной системы.

Несмотря на значительное отличие ответной реакции в группе детей, принимавших пробиотик и в группе плацебо, дети, принимавшие плацебо, нормально росли и к концу исследования время плача у них уменьшилось. Таким образом, прием плацебо оказывал существенное воздействие, которое отмечалось в предшествующих исследованиях с участием детей с коликами. Hill и соавторы, (20) предположили, что реакция на плацебо возникала вследствие того, что матери детей не употребляли коровье молоко или, вероятнее всего, вследствие физиологического взросления. FISH-анализ продемонстрировал значительное увеличение количества лактобактерий в стуле после приема L reuteri и, что важно, при проведении анализа выборочных штаммов, употребляемые бактериальные штаммы были выявлены только у этих детей. Была продемонстрирована устойчивость L reuteri DSM 17 938 к кислой среде желудка и способность временно колонизировать весь желудочно-кишечный тракт после перорального приема (11,21,22). Вероятно, это также оказывает воздействие на физиологию человека. E coli является частью нормальной кишечной микрофлоры человека, но ее традиционно рассматривают как распространенную причину желудочно-кишечных заболеваний (23,24) и внекишечных инфекций, таких как инфекция мочевыводящих путей (25) и неонатальный сепсис. (26) Мы предположили наличие взаимосвязи между численностью колиформных видов и уменьшением других полезных бактерий. Мы полагаем, что ферментация E coli в толстой кишке оказывает воздействие на избыточное давление воздуха в кишечнике и последующую боль, что типично для детских колик. Мы ранее сообщали о преобладании колиформных бактерий, в частности E coli, у детей с коликами по сравнению со здоровыми детьми, указывая на роль E coli в детских коликах. (8) Эти факты вместе с настоящими данными в отношении значительного уменьшения количества E coli в стуле во время приема L reuteri, но не во время приема плацебо, указывают, что L reuteri благоприятно воздействует на состояние кишечника путем уменьшения колонизации E coli. Протеолитические бактерии, такие как фузобактерии, пропионобактерии и клостридии, главным образом ферментируют аминокислоты, что приводит к выработке некоторых токсичных метаболических конечных продуктов, включая аммиак и индол. (27) Таким образом, рост колиформных бактерий и ферментация углеводов воздействуют на абсорбцию аммиака и переработку и выведение азота мочевины. Heavey и соавторы (28) сообщили, что уровень аммиака в стуле значительно различается у детей, находящихся на грудном вскармливании и у детей на искусственном вскармливании. Наблюдаемое уменьшение уровня аммиака в стуле у детей, находящихся на грудном вскармливании и получающих L reuteri, может быть связано с изменением активности бактериальных ферментов посредством уменьшения количества E coliи других составляющих кишечной микробиоты и более быстрого захвата люминального NH3 в виде NH4+.

L reuteri широко используется в пищевых продуктах и добавках для детей и младенцев (в двух клинических исследованиях отмечалась ее хорошая переносимость), (10,29,30) а также в клинической практике (в литературе отсутствуют указания на возникновение нежелательных явлений). Наши наблюдения за здоровыми детьми младше 2 месяцев, находящимися на грудном вскармливании, подтверждают хорошую переносимость нового штамма.

ВЫВОДЫ

Прием L reuteri DSM 17 938 у детей с коликами является хорошо переносимым, препарат улучшает симптомы детских колик по сравнению с приемом плацебо. Это действие может быть связано с изменениями в фекальной микробиоте, особенно в отношении E coli. Обнаруженные данные указывают на роль аномальной бактериальной флоры в патогенезе детских колик и на возможность избавления от этой проблемы путем приема пробиотиков.

БЛАГОДАРНОСТЬ

Это исследование финансировала компания БиоГая АБ (BioGaia AB) (Стокгольм, Швеция). Мы благодарим Francesca Verna и Emanuela Locatelli за сбор образцов стула и Cecilia Petrén и Klara Båth за анализ L reuteri в стуле.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Roberts DM, Ostapchuk M, O’Brien JG. Infantile colic. Am Fam Physician. 2004;70(4): 735–740

2. Savino F. Focus on infantile colic. Acta Paediatr. 2007; 96(9):1259 –1264

3. Wessel MA, Cobb JC, Jackson EB, Harris GS Jr, Detwiler AC. Paroxismal fussing in infancy, sometimes called “colic.” Pediatrics. 1954;14(5):421– 435

4. Keefe MR, Kajrlsen KA, Lobo ML, Kotzer AM, Dudley WN. Reducing parenting stress in families with irritable infants. Nurs Res. 2006;55(3):198 –205

5. Gupta SK. Is colic a gastrointestinal disorder? Curr Opin Pediatr. 2002;14(5):588 –592

6. Savino F, Cresi F, Pautasso S, et al. Intestinal microflora in breastfed colicky and noncolicky infants. Acta Paediatr. 2004;93(6): 825– 829

7. Savino F, Bailo E, Oggero R, et al. Bacterial counts of intestinal Lactobacillus species in infants with colic. Pediatr Allergy Immunol. 2005;16(1):72–75

8. Savino F, Cordisco L, Tarasco V, Calabrese R, Palumeri E, Matteuzzi D. Molecular identification of coliform bacteria from colicky breastfed infants. Acta Paediatr. 2009; 98(10):1582–1588

9. Rhoads JM, Fatheree NY, Norori J, et al. Altered fecal microflora and increased fecal calprotectin in infants with colic. J Pediatr. 2009;155(6):823.e1– 828.e1

10. Savino F, Pelle E, Palumeri E, Oggero R, Miniero R. Lactobacillus reuteri (American type culture collection strain 55 730) versus simethicone in the treatment of infantile colic: a prospective randomized study. Pediatrics. 2007;119(1). Available at: www. pediatrics.org/cgi/content/full/119/1/e124

11. Rosander A, Connolly E, Roos S. Removal of antibiotic resistance plasmids from Lactobacillus reuteri ATCC 55 730 and characterization of the resulting daughter strain, L reuteri DSM 17 938. Appl Environ Microbiol. 2008;74(19):6032– 6040

12. Egervärn M, Lindmar H, Olsson J, Roos S. Transferability of a tetracycline resistance gene from probiotic Lactobacillus reuteri to bacteria in the gastrointestinal tract of humans. Antonie Van Leeuwenhoek. 2010; 97(2):189 –200

13. Searcy RL, Reardon JE, Foreman JA. A new photometric method for serum urea nitrogen determination. Am J Med Technol. 1967; 33(1):15–20

14. Chaney AL, Marbach EP. Modified reagents for determination of urea and ammonia. Clin Chem. 1962;8:130 –132

15. Van Niel CW. Probiotics: not just for treatment anymore. Pediatrics. 2005;115(1): 174 –177

16. Rautava S, Kalliömaki M, Isolauri E. New therapeutic strategies for combating the increasing burden of allergic diseases: probiotics—a Nutrition, Allergy, Mucosal Immunology and Intestinal Microbiota (NAMI) Research Group report. J Allergy Clin Immunol. 2005;116(1):31–37

17. Indrio F, Riezzo G, Raimondi F, et al. The effects of probiotics on feeding tolerance, bowel habits, and gastrointestinal motility in preterm newborns. J Pediatr. 2008; 152(6):801– 806

18. Kunze WA, Mao YK, Wang B, et al. Lactobacillus reuteri enhances excitability of colonic AH neurons by inhibiting calcium dependent potassium channel opening. J Cell Mol Med. 2009;13(8B):2261–2270

19. Wang B, Mao YK, Diorio C, et al. Lactobacillus reuteri ingestion and IK(Ca) channel blockade have similar effects on rat colon motility and myenteric neurones. Neurogastroenterol Motil. 2010;22(1):98 –107, e33

20. Hill DJ, Roy N, Heine RG, et al. Effect of a lowallergen maternal diet on colic among breastfed infants: a randomized, controlled trial. Pediatrics. 2005;116(5). Available at: www.pediatrics.org/cgi/content/full/116/5/e709

21. Wall T, Båth K, Britton RA, Jonsson H, Versalovic J, Roos S. The early response to acid shock in Lactobacillus reuteri involves the ClpL chaperone and a putative cell wallaltering esterase. Appl Environ Microbiol. 2007;73(12):3924 –3935

22. Abrahamsson TR, Sinkiewicz G, Jakobsson T, Fredrikson M, Björkstén B. Probiotic lactobacilli in breast milk and infant stool in relation to oral intake during the first year of life. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2009; 49(3):349 –354

23. Nowrouzian F, Hesselmar B, Saalman R, et al. Escherichia coli in infants’ intestinal microflora: colonization rate, strain turnover, and virulence gene carriage. Pediatr Res. 2003;54(1):8 –14

24. Rhodes JM. The role of Escherichia coli in inflammatory bowel disease. Gut. 2007; 56(5):610–612

25. Yamamoto S. Molecular epidemiology of uropathogenic Escherichia coliJ Infect Chemother. 2007;13(2):68 –73 

26. Hammerman C, Kaplan M. Probiotics and neonatal intestinal infection. Curr Opin Infect Dis.2006;19(3):277–282

27. Holdeman, LV, Cato EP, Moore WEC. Anaerobe Laboratory Manual. 4th ed. Blacksburg, VA: Virginia Polytechnic Institute and State University; 1977

28. Heavey PM, Savage SAH, Parrett A, Cecchini C, Edwards CA, Rowland IR. Proteindegradation products and bacterial enzyme activities in faeces of breast-fed and formulafed infants. Br J Nutr. 2003;89(4): 509 –515

29. Weizman Z, Alsheikh A. Safety and tolerance of a probiotic formula in early infancy comparing two probiotic agents: a pilot study. J Am Coll Nutr. 2006; 25(5):415– 419

30. Abrahamsson TR, Jakobsson T, Bottcher MF, et al. Probiotics in prevention of IgE-associated eczema: a double-bind, randomized, placebo-controlled trial. J Allergy Clin Immunol. 2007;119(5): 1174 –1180